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EMBO Reports | EB病毒编码环状RNA调控胃癌干细胞“干性”
來源: | 作者:geneseed | 發布時間: 2020-08-18 | 224 次浏覽 | 分享到:
8月12日,EMBO Reports雜志在線發表了一項環狀RNA的重要研究工作,報道EB病毒編碼的環狀RNA可以調控胃癌幹細胞的“幹性”。文章的通訊作者是中山大學附屬第三醫院的邵春奎主任

我們有幸邀请到本文的第一作者为我們做精彩的解读,并向大家分享了他们开展本项研究中的一些经验和心得,以下內容为文章作者撰写:


EB 病毒相关胃癌(EBVaGC)是胃癌四种分子亚型中的一种,具有独特的遗传学改变和分子标记,胃癌中构成比占10%。目前關于 EBV 致 EBVaGC 的分子机制尚不清楚。在本文中,作者在低剂量的化疗药物5-氟尿嘧啶压力下,通过在小鼠体内进行连续的移植瘤传代,筛选出耐药的 EBVaGC干细胞的细胞株,接着对这些肿瘤干细胞中病毒来源的环状RNA进行高通量測序分析。基于这一模型,筛选出高表达的EB病毒环状RNA ebv-circLMP2A,发现ebv-circLMP2A参与维持 EBVaGC 干细胞 “干性”生物学行为,并且 ebv-circLMP2A 的高表达与 EBVaGC 患者的淋巴结累及、远处转移、 TNM 分期以及较差的预后显著相关。进一步机制研究发现 ebv-circLMP2A 通过调控hsa-miR-3908/TRIM59/p53 通路维持 EBVaGC 干细胞 “干性” 生物学行为,从而促进EBVaGC的发生发展。本文的发现为靶向EBVaGC防治提供了新的治疗靶点。该研究针对病毒与肿瘤的关系这个热点问题开展工作,具有重要的科学意义。下面我們就详细了解一下这篇文章的主要內容:



1、EBVaGC幹細胞的富集與鑒定

肿瘤干细胞(CSCs) 具有自我更新和耐药特性,能够抵抗化疗药物的杀伤作用。基于这一规律,作者首先将EBVaGC细胞株SNU719接种到免疫缺陷的NOD/SCID鼠皮下,每周一次通过尾静脉给予低剂量化疗药物5-Fu,对照组给与同样剂量的PBS。当肿瘤生长到1.5cm时,取出移植瘤组织,进行原代培养获得肿瘤单细胞悬液。用上述同样的方法再次种植到NOD/SCID鼠皮下,并给予上述化疗,如此传代3次,筛选出富含化疗耐药的EBVaGC干细胞 的细胞株模型SNU-4th细胞。实验发现:SNU-4th 细胞的自我更新能力、单细胞成球能力、迁移和侵袭能力、克隆形成能力、在无血清培养条件下的增殖能力、侧群细胞比例均高于亲本 SNU719 细胞;SNU-4th 细胞具有稳定的 EMT 特性;通用干性分子标记(Klf4,Oct4,Bmi1,Sox 2 )与耐药基因(ABCG2,Mrp1)的表达在 SNU-4th 细胞中显著升高。流式细胞术进一步分析发现 SNU-4th 细胞主要是由 CD44+CD24- 的细胞亚群构成。


图1 低剂量化疗压力下富集EBVaGC 干细胞([1]



2、第四代異體移植瘤組織中EB病毒circRNA的表達譜分析
接下来,作者将富集 EBVaGC 干细胞第四代 5-Fu 处理和 PBS 处理的异体移植瘤组织进行环状 RNA 高通量測序,共鉴定出261个ebv-circRNA。与来源于人类基因组编码的环状RNA相似,大部分的ebv-circRNA 长度在300到600个核苷酸之间,主要来源于编码蛋白质的外显子。此外,同一个EBV基因可以产生多种由不同外显子或内含子构成环状RNA异构体。

图2 第四代異體移植瘤組織中EB病毒circRNA的表達譜分析([1]


3、
ebv-circLMP2A的發現

作者通過對測序數據的深入分析發現:EBV編碼的潛伏膜蛋白基因LMP2A産生的circRNA(ebv-circLMP2A),其表達在5-Fu處理的第四代異體移植瘤組織中顯著升高;進一步在SNU-4th、SNU719與YCCEL1細胞中進行驗證,證明ebv-circLMP2A在EBVaGC幹細胞SNU-4th中表達顯著升高;後續分析ebv-circLMP2A的表達與EBVaGC臨床病理因素及預後的關系發現,ebv-circLMP2A的高表達與患者的淋巴結累及、遠處轉移、TNM分期以及較差的預後顯著相關。以上結果提示我們ebv-circLMP2A在促進EBVaGC進展中起到重要作用。


图3 ebv-circLMP2A 的环状特性分析及和临床预后的关系([1]


4、
體內外敲低ebv-circLMP2A可抑制SNU-4th細胞“幹性”生物學行爲

为进一步探索ebv-circLMP2A在EBVaGC 干细胞中的功能,作者设计了3条靶向ebv-circLMP2A反向拼接位点周围序列的sh-RNA。实验发现:在SNU-4th细胞中,干扰ebv-circLMP2A的表达后,可抑制 SNU-4th 细胞的球囊形成能力、迁移和侵袭能力、克隆形成能力、侧群细胞比例、通用干性分子标记(Klf4,Oct4,Bmi1,Sox 2 )与耐药基因(ABCG2,Mrp1)的表达以及抗5-Fu诱导的凋亡能力。此外 NOD/SCID 鼠皮下移植瘤和肺转移模型显示,抑制 ebv-circLMP2A 的表达可以明显抑制皮下移植瘤的生长与肺部转移。


图4 干扰ebv-circLMP2A 表达后,可抑制SNU-4th细胞“干性”生物学行为([1]


5、
過表達ebv-circLMP2A誘導普通EBVaGC細胞株出現“幹性”生物學行爲

进一步,作者在普通的EBVaGC 细胞株SNU719与YCCEL1细胞中过表达 ebv-circLMP2A,Northern Blot检测过表达的效率。体内外实验进一步证实,过表达ebv-circLMP2A可诱导普通 EBVaGC 细胞株出现“干性”生物学行为。


图5 过表达ebv-circLMP2A 表达诱导普通EBVaGC细胞出现“干性”生物学行为 ([1]


6、
ebv-circLMP2A通過海綿機制吸附大量miR-3908

作者在对ebv-circLMP2A进行环状特性分析时,发现其主要存在于细胞质中,这是circRNA发挥“miRNA Sponge”作用的前提。接下来,作者借助miRanda与TargetScan两个数据库对ebv-circLMP2A序列中miRNA识别元件进行预测并将预测结果重叠,筛选出7个候选miRNA,通过荧光定量PCR分析、RNA pull down实验、RNA 共定位实验发现miR-3908是ebv-circLMP2A的下游靶分子,双荧光素酶报告基因实验进一步证实ebv-circLMP2A主要通过位点1和3吸附miR-3908。


图6  ebv-circLMP2A通过海绵吸附miR-3908 ([1]


7、
過表達miR-3908逆轉了ebv-circLMP2A誘導的“幹性”表型

为进一步了解miR-3908在ebv-circLMP2A维持EBVaGC 干细胞“干性”生物学行为中的具体作用机制,作者将miR-3908 mimic 转染到SNU-4th细胞中,发现过表达miR-3908可明显抑制SNU-4th细胞“干性”表型,进一步将miR-3908 mimic和ebv-circLMP2A共转染到SNU-4th细胞中,发现miR-3908可明显逆转ebv-circLMP2A对SNU-4th细胞“干性”表型的促进作用。此外,进一步在EBVaGC组织中分析miR-3908的表达和ebv-circLMP2A的关系,发现两者之间的表达呈负相关,miR-3908高表达患者其总生存率显著上升。


图7 过表达miR-3908逆转了ebv-circLMP2A 诱导的“干性”表型([1]


8、
ebv-circLMP2A通過抑制miR-3908表達參與上調TRIM59表達,最終導致p53蛋白表達下調

为进一步研究miR-3908抑制SNUN-4th细胞“干性”表型的下游通路,作者借助生物信息学技术和双荧光素酶报告基因实验发现TRIM59是miR-3908的下游靶基因。细胞水平上进一步证实了ebv-circLMP2A通过吸附miR-3908,上调miR-3908下游靶基因TRIM59的表达。在临床样本还发现TRIM59的高表达与患者的临床T分期显著相关。研究表明TRIM59在胃癌中高表达,并可通过促进 p53 蛋白酶体依赖的泛素化降解使得 p53蛋白表达下调,抑制 p53蛋白抑癌功能的行使,从而促进胃癌的发生发展。因此作者又进一步探索了ebv-circLMP2A对TRIM59下游分子p53蛋白表达的调控作用,实验发现,在高表达ebv-circLMP2A的临床样本中,其CD44+CD24- 的细胞比例升高,而p53+ 的细胞亚群显著减少,进一步证实ebv-circLMP2A最终通过下调p53蛋白的表达参与维持EBVaGC干细胞“干性”生物学行为。


图8 ebv-circLMP2A通过抑制miR-3908参与上调TRIM59表达,最终导致p53蛋白表达下调([1]


9、
ebv-circLMP2A維持EBVaGC幹細胞“幹性”表型機制彙總

在本研究中,作者利用CSCs对常规化疗耐药的特性,在低剂量的化疗药物5-Fu压力下,通过在小鼠体内进行连续的移植瘤传代,筛选出富含化疗耐药EBVaGC干细胞的细胞株SNU-4th,发现EBV来源的环状RNA ebv-circLMP2A其表达在5-Fu处理的异体移植瘤组织中和EBVaGC干细胞株SNU-4th中显著上调,并且ebv-circLMP2A的高表达与EBVaGC患者的淋巴结累及、远处转移、TNM分期以及较差的预后显著相关。机制研究发现ebv-circLMP2A通过调控hsa-miR-3908/TRIM59/p53通路维持EBVaGC干细胞的“干性”表型。


图9 ebv-circLMP2A維持EBVaGC幹細胞“幹性”表型機制彙總 ([1]


研究經驗分享:

編者問

這項工作研究過程中你覺得最重要,最困惑的問題是什麽?你們怎麽解決的?


Emma答

應該就是如何找到circLMP2A這個分子,當時測序數據中這個ebv-circRNA的表達並不是最高的,一開始選的是另外一個豐度最高的ebv-circRNA,但是當時在構建敲低載體時,發現這個circRNA的很難特異性敲低,後面比較難做表型。circLMP2A這個分子呢,其母基因本身就是一個非常著名的EB病毒致癌基因,在我們前期構建的移植瘤標本中又一致性上調,後來就選了circLMP2A往下做。

參考文獻

1. Gong, L.P., et al., Epstein-Barr virus-derived circular RNA LMP2A induces stemness in EBV-associated gastric cancer. EMBO Rep, 2020: p. e49689.