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 circRNA服務

circRNA服務?
circRNA AAV与慢病毒包裝服务
來源: | 作者:geneseed | 發布時間: 2018-03-29 | 12180 次浏覽 | 分享到:
1. circRNA AAV包装服务
1.1 腺相关病毒(AAV)简介
        腺相關病毒(Adeno-Associated Viral Vector,AAV)是一类微小的单链DNA病毒,直径约20-30nm,它依赖于其他病毒(如腺病毒)进行复制。AAV基因组约4700bp,包括上下游两个开放读码框架(ORF),位于分别由145bp组成的2个反向末端重复序列(ITR)之间。重组腺相关病毒(Recombinant AAV,rAAV)去除了其基因组的全部编码蛋白序列Rep和Cap,只留两端带有ITR序列作为包装信号。1984年始rAAV载体被证明能转导外源基因进入哺乳动物细胞内,1990年被FDA认可,成为用于临床的安全基因傳遞載體。現在AAV因具有宿主範圍廣、安全性高、免疫原性低、表達穩定和物理性質穩定等優點,已被廣泛地應用于基礎研究和臨床試驗。
        至今,已出上百种自然界AAV血清型和经工程改造外壳的 AAV 载体。这些载体具有不同的器官、组织特异性及其它独特的性质,让基因转导工具的选择更丰富更个性化。

 
 图1 AAV基因组结构

1.2 腺相关病毒(AAV)生物学特性

表1 不同病毒的生物学特性比较

AAV病毒特點

        1 安全性高:野生型AAV暫未發現對人體致病,重組AAV去除了大部分基因組元件,更爲安全;
        2 免疫原性低:AAV的基因组仅4700bp,进行動物實驗时造成的免疫反应小;
        3 宿主范围广:能感染分裂細胞和非分裂細胞,可用于細胞水平和動物水平;
        4 表达稳定:能介導基因在一定時期內的穩定表達;
        5 病毒稳定:在-80℃可長期保存。


1.3 腺相关病毒(AAV)载体不同血清型
        研究发现AAV具有多种血清型,各种不同血清型的AAV载体的主要区别是衣壳蛋白不同,因此对不同的组织和细胞的转染效率存在差异。由于相同的 AAV 血清型在啮齿类动物及灵长类动物中的感染特性不尽相同,在文献中对各组织的 AAV 血清型感染能力比较可能存在不同结果,可以参考前人的研究结果,针对不同组织器官选择相应血清型的AAV病毒,或通过预实验测试确定理想的血清型。
 表2 动物体内实验血清型推荐(小鼠)





1.4
 
circRNA過表達腺相關病毒(AAV)結果展示
 
 CNE2细胞(AAV感染48h)                  小鼠结肠组织(AAV感染3周)


        小鼠尾静脉注射AAV 三周后提取组织RNA进行荧光定量PCR检测;与注射空白对照病毒组相比,注射Has_circ_0000147 过表达病毒组的小鼠,在心肌组织和肝脏组织中Has_circ_0000147表达量明显上调,分别是对照组的69倍和142倍。
   


        293细胞感染不同circRNA過表達AAV 48h后提取RNA进行荧光定量PCR检测,与感染对照病毒组相比,过表达AAV组上调几百至几千倍。


  


1.5 腺相关病毒(AAV)服务內容




2. circRNA 慢病毒包裝服务

2.1 慢病毒简介
        慢病毒(Lentivirus)是逆转录病毒的一种。以慢病毒基因组为基础,由所需的目的基因取代部分基因构建而成现在常用的慢病毒载体,已成为生物科研工作中重要的研究工具。慢病毒载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上,从而实现持久表达。在感染能力方面,我們提供的慢病毒其外壳蛋白为 VSVG,可以有效感染分裂和非分裂细胞,应用十分广泛。现使用的慢病毒为“自杀”性病毒,即病毒感染目的细胞后不会再感染其他细胞,也不会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒,使用更加安全。不过,虽然慢病毒中的毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代,属于假型病毒,但该病毒仍然具有潜在的生物学危险,建议不要使用编码已知可能会致癌或有毒性的基因的假型病毒。我公司推出的circRNA 过表达载体pLO5-ciR、pLC5-ciR均为慢病毒载体,可用于瞬時轉染或慢病毒包裝。  


2.2 慢病毒生物学特性
        1 安全性高:慢病毒中的毒性基因已經被剔除並被外源性目的基因所取代,屬于假型病毒;
        2 宿主范围广:能感染分裂細胞和非分裂細胞,可用于細胞水平和動物水平;
        3 表达稳定:高頻整合,通過篩選可以獲得穩定表達細胞株;
        4 插入基因长度大:一般線性序列6k以內可以構建載體,circRNA因環化效率限制,一般建議200-2000bp。


2.3 circRNA過表達慢病毒結果展示

 

 293細胞(慢病毒感染48h)             U87细胞(慢病毒感染48h)



        293細胞感染circRNA過表達慢病毒48h後篩選,獲得穩定細胞株後提取RNA,進行PCR檢測。與感染對照病毒組相比,過表達慢病毒組明顯上調。

            

2.4 慢病毒服务內容